导读 在这项研究中，团队开发了一种有效的组织清除方法，用于全脑空间三维（3D）RNA成像。

2024年11月21日，瑞典卡罗林斯卡医学院在期刊《Science》上发表了题为“Whole-brain spatialtranscriptional analysis at cellular resolution”的研究论文。TRISCO解决了几个关键问题，包括保持RNA的完整性、实现均匀的RNA标记和提高组织透明度。TRISCO有望成为单细胞、全脑三维成像的强大工具，可对整个大脑进行全面的转录空间分析。

       

https://www.science.org/doi/10.1126/science.adn9947

关于TRISCO

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要了解细胞的空间关系及其参与的回路，就必须在全脑范围内对分子进行三维（3D）可视化。目前科学界已发表了多种组织清理方案，用于成像体积，其中绝大多数方案侧重于评估蛋白质而非RNA转录物的分布。虽然有一些开创性的方案尝试将RNA成像与组织清理相结合，但应用于较大的组织，如整个哺乳动物大脑，仍然具有挑战性。

       

团队最近开发了原位免疫荧光标记清除样本（DIIFCO）诊断技术，该技术结合了原位HCR（isHCR）和有机溶剂清除技术，用于研究小鼠胚胎、脑切片和临床活组织切片中的RNA。鉴于对全脑空间转录分析的高需求，团队对成人全脑样本进行了DIIFCO评估，但得出的结论是，由于RNA的完整性差、标记不均匀和透明度弱等问题，这种方法不适合对完整大脑中的RNA进行可视化。

       

在这项研究中，团队提出了一种新技术--Tris缓冲液介导的清除器官中isHCR信号的保留（TRISCO），它可以在有机溶剂清除后，对具有均匀isHCR信号和高组织透明度的全脑进行空间RNA分析。TRISCO为实现单细胞分辨率的全脑三维成像提供了一种简单易行的方法，它能捕获全面的转录本阵列，从而揭示整个大脑的转录景观。

TRISCO可实现单细胞分辨率的全脑RNA成像

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团队使用共聚焦显微镜进行了定量分析，计数并比较了从三维TRISCO染色大脑切取的组织切片中Csf1r阳性细胞的数量，以及使用传统isHCR染色的组织切片中Csf1r阳性细胞的数量。这项分析表明，二维和三维方法在纹状体中检测到的Csf1r阳性细胞的百分比几乎相同，这表明TRISCO可以覆盖整个区域。此外，团队还分析了与多巴胺、血清素和乙酰胆碱等大脑高级功能神经递质有关的RNA转录物的表达：Th、Slc18a2、Slc6a3、Tph2、Ddc、Maoa、ChAT、Slc13a3和Ache。TRISCO揭示了大脑深部结构的特定基因表达模式，如基底节和脑干。体积渲染和放大进一步突显了PvalbmRNA和ThmRNA错综复杂的转录模式，以单细胞分辨率解析了整个小鼠大脑的转录模式。

       

各种RNA转录本的全脑TRISCO染色。

评估跨哺乳动物器官和神经元活动的TRISCO成像

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为了评估TRISCO检测整个大脑功能性神经元活动的能力，团队评估了接受药理学治疗的小鼠体内早期基因c-Fos的表达情况。团队观察到，与药物治疗小鼠相比，食欲和体重调节相关的不同区域的c-FosmRNA表达增强。为了验证TRISCO的结果，团队使用免疫标记的溶剂清除器官三维成像技术（iDISCO），将c-FosmRNA表达与c-Fos蛋白免疫染色进行了比较。分析结果显示，孤束核和脐旁核的mRNA和蛋白计数相似。

       

总之，这些数据表明，TRISCO是一种强大的工具，可用于全面研究整个大脑中的细胞特征、非编码RNA表达和调控基因的转录。

       

利用c-Fos标志对大型啮齿动物大脑和神经元活动，进行全脑TRISCO分析。

总结

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1. TRISCO技术的优势：TRISCO技术通过低温孵育实现均匀染色，减少了图像处理中的归一化需要，并且可以设计和使用定制探针，覆盖广泛的RNA物种。

       

2. 简易性和多功能性：TRISCO技术易于使用，无需专业设备，可应用于各种实验室环境，并且有效于不同大小的大脑，如小鼠、大鼠和豚鼠。

       

3. 可扩展性和适用性：TRISCO技术不仅适用于脑部成像，还适用于脊髓、心脏、肾脏和肺部等多种组织，拓宽了其潜在应用领域。

       

4. 局限性与改进潜力：TRISCO技术存在一些局限性，如信噪比和渗透问题，但这些可以通过优化关键参数和样品制备方法来克服。

       

5. 多轮分析的潜力：预计通过优化组织清除和探针移除，TRISCO可以实现多轮分析，提高多重分析能力。

       

6. 自动化和实用性：通过加快程序和增强探针穿透力，TRISCO技术有望变得更加实用，实现高含量三维成像。

       

7. 三维转录数据的宝库：TRISCO技术的开发，标志着高性能成像技术的巨大进步，开启了尚未开发的庞大三维转录数据宝库。

       

8. 神经科学研究的关键缺口：TRISCO技术通过实现RNA转录本的体积可视化和分析，弥补了神经科学研究中的一个关键缺口，将神经转录本概况与空间坐标联系起来，探索大脑的动态复杂景观。

       

        参考资料：

       
       

        1.P. Ariel, A beginner’s guide to tissue clearing. Int. J. Biochem. Cell Biol. 84, 35-39 (2017).

       
       

        2.H. R. Ueda, A. Ertürk, K. Chung, V. Gradinaru, A. Chédotal, P. Tomancak, P. J. Keller, Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nat. Rev. Neurosci. 21, 61-79 (2020).